如何制備感受態細胞?

 一、原理：


目前，感受態細胞的制備常用冰預冷的CaCl2處理細菌的方法制備，即用低滲CaCl2溶液在低溫（0℃）時處理快速生長的細菌，從而獲得感受態細菌。此時細菌膨脹成球形，外源DNA分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附在細菌表面，通過熱激作用促進細胞對DNA的吸收。轉化效率可達106-107轉化子/微克DNA。本方法的關鍵是選用的細菌必須處于對數生長期，實驗操作必須在低溫下進行。


二、操作：


1.取-70℃冰凍菌種，用劃線法接種細菌于培養皿，做好標記，于37℃培養過夜。


2.第二天，從平板上挑取單個菌落，接種至含有3ml LB培養液的試管中，37℃振蕩培養過夜。次日取菌液1ml接種至含有100ml LB培養基的500ml燒瓶中，37℃劇烈震蕩培養約2~3小時（200~300r/min）


3.當菌落600nm OD值達到0.3-0.4時，將燒瓶取出放置冰上10~15分鐘。在無菌條件下把菌液倒入50ml離心管中。4℃，4000g離心10分鐘。


4.棄上清，將管倒置于干濾紙上1min，吸干殘留的培養液。加10ml 0.1M的CaCl2到離心管中，振蕩混勻，懸浮菌體，冰浴30分鐘。


5.4℃，4000g離心10分鐘，棄上清，將管倒置于干濾紙上1min，吸干殘留的培養液。加4ml冰預冷的0.1M的CaCl2,重懸浮菌體。每管0.2ml分裝，至4℃保存備用，24-48小時內使用效果較好。如果暫時不用，可再保存于-70℃的低溫冰箱中。


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