前言：雙抗夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）是zui典型的免疫分析法，被廣泛用于檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)工作中疾病診斷、食品安全、環(huán)境分析等領(lǐng)域。
抗原抗體結(jié)合的特異性，酶催化反應(yīng)的專一性，生物素和親和素級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)都極大地提高了雙抗夾心法ELISA檢測(cè)的靈敏度，對(duì)檢測(cè)物的快速診斷提供了重要保證。然而，ELISA從標(biāo)本制備到結(jié)果檢測(cè)的任何一個(gè)步驟都影響了zui終結(jié)果的判讀。今天上海恒遠(yuǎn)分享一篇影響雙抗夾心法ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的七大因素分析，希望能幫助到您！
1、樣本和檢抗的加樣方式：
雙抗夾心法ELISA常規(guī)檢測(cè)方法是樣品、抗體試劑單獨(dú)加入。但有些試劑盒推薦樣品和檢測(cè)抗體一起加來縮減步驟從而加快檢測(cè)的時(shí)間。然而由于游離的樣品和檢測(cè)抗體先結(jié)合后形成空間位阻效應(yīng)，可能會(huì)影響樣品和包被抗體的結(jié)合。所以，一般不建議將ELISA步驟中樣品和檢測(cè)抗體一同孵育。
2、孵育溫度：
孵育溫度可以選擇25℃，這樣可以降低檢測(cè)的背景而又可以保持其在37℃下的檢測(cè)靈敏度。然而在OD值整體偏低的情況，就不建議這么做了。
3、封閉與否：
牛血清白蛋白在ELISA反應(yīng)中可以防止酶的分解和非特異性吸附。但是封閉并不是對(duì)所有的ELISA體系都必須。有實(shí)驗(yàn)表明，牛血清白蛋白封閉并不能提高ELISA體系的檢測(cè)靈敏度，反而影響了低濃度樣品的檢測(cè)。原因可能是高濃度下的牛血清白蛋白可能會(huì)影響低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品/樣本與抗體結(jié)合，導(dǎo)致檢測(cè)的靈敏度降低。因此，只要抗體的活性高，也可以不用封閉這一常用的步驟。
4、洗液中吐溫濃度：
吐溫20是陰離子表面活性劑，防止了抗原抗體的非特異性結(jié)合同時(shí)也防止后面的抗體或樣品吸附到微孔板上，因此ELISA包被抗體時(shí)一定不能含有吐溫20，但是包被以后的步驟中的緩沖液都可以含有吐溫20，其濃度在0.05%為*。
5、樣本嚴(yán)重溶血：
樣本嚴(yán)重溶血紅細(xì)胞破壞溶解時(shí)，釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過氧化物酶為標(biāo)記的ELISA測(cè)定試驗(yàn)中，容易在溫育過程中吸附于微孔板，從而與加入的底物反應(yīng)顯色，干擾測(cè)定結(jié)果，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
6、樣本污染：
樣本的污染菌體可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)非特異性顯色。因此，ELISA檢測(cè)應(yīng)采集新鮮樣本。
影響ELISA的因素還有很多，例如，酶標(biāo)板的選擇，包被緩沖液的種類，包被抗體的pH避免與包被緩沖液的pH相同等小細(xì)節(jié)。
7、邊緣效應(yīng)：
邊緣效應(yīng)是在使用96孔板的ELISA測(cè)定中，外周孔顯色較中心孔深的現(xiàn)象。產(chǎn)生的原因可能是96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學(xué)梯度造成的，因此在溫育時(shí)盡量采用水浴。
看完以上內(nèi)容，您是否覺得科研之路深似海？上海恒遠(yuǎn)提醒：ELISA測(cè)定的應(yīng)用非常廣泛，雖然其操作步驟簡單，但影響ELISA檢測(cè)的因素也非常多，分布在ELISA反應(yīng)全過程的每一個(gè)環(huán)節(jié)，科研人員要根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣品和抗體建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的操作流程，才能得到穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果您在實(shí)驗(yàn)中遇到任何不明白的問題，都可本公司，我們將為您免費(fèi)安排技術(shù)指導(dǎo)服務(wù)哦！
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